Mögliche Vorteile einer Mischung aus ätherischen Ölen für den Stoffwechsel, die Verdaulichkeit, die Organentwicklung und die Genexpression von Milchkälbern

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 3378 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das Ziel dieser Studie bestand darin, Blutzellen und Metaboliten, den insulinähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF-1), die Verdaulichkeit, das Gewicht und die Histologie der inneren Organe, die Genexpression und die Milzzellproliferation von vorab entwöhnten Bullenkälbern, denen a zugesetzt wurde, zu bewerten Mischung ätherischer Öle in Milchaustauscher (MR). Sechzehn neugeborene Holstein × Gyr-Kreuzungs-Milchbullenkälber mit einem Geburtsgewicht von 33,3 ± 3,7 kg wurden in einzelnen Sandstreuställen gehalten, aufgrund der genetischen Zusammensetzung blockiert und zufällig einer von zwei Behandlungen in einem randomisierten vollständigen Blockdesign zugewiesen: Kontrolle (CON, n = 8) und eine Mischung aus ätherischen Ölen als Ergänzung (BEO, n = 8, 1 g/Tag/Kalb, Apex Calf, Adisseo, China). Die kommerzielle Mischung bestand aus Pflanzenextrakten aus Anis, Zimt, Knoblauch, Rosmarin und Thymian. Den Tieren wurden 5 l MR/Tag, rekonstituiert zu 15 % (Trockenmassebasis), verabreicht, aufgeteilt auf zwei gleiche Mahlzeiten. Wasser und Starter wurden nach Belieben bereitgestellt. ß-Hydroxybutyrat, Harnstoff und Glukose wurden wöchentlich untersucht, IGF-1 wurde alle zwei Wochen untersucht und die Gesamtblutzellzählung wurde alle vier Wochen bis zum Ende des Versuchs im Alter von acht Wochen durchgeführt. Dreimal pro Woche wurden Futterproben entnommen und zur wöchentlichen Analyse abgefragt. Die scheinbare Gesamtnährstoffverdaulichkeit wurde im Alter von 56 bis 60 Jahren bestimmt. Am Tag 60 ± 1 wurden die Tiere zur Untersuchung des Organgewichts, der Histologie, der Milzzellproliferation und der Analyse der intestinalen Genexpression eingeschläfert. Die Daten wurden unabhängig voneinander mithilfe linearer gemischter Modelle unter Verwendung der REML-Methode im NLME-Paket in R für kontinuierliche Ergebnisse analysiert. Für geordnete kategoriale Ergebnisse wurde ein nichtparametrischer Test unter Verwendung des Artools-Pakets in R verwendet. Es gab keine Unterschiede zwischen den Gruppen hinsichtlich Blutuntersuchungen, Verdaulichkeit, Genexpression und einem Milzzellproliferationstest. BEO-Kälber wiesen jedoch eine schwerere Bauchspeicheldrüse, einen schwereren Darm, größere Ileumzotten und höhere Blinddarmbutyratwerte (P < 0,05) auf, was zeigt, dass die EO-Supplementierung die Darmentwicklung und symbiotische Bakterien förderte. Es wurde auch bei CON-Tieren mit schwereren Atemwegen und einer höheren Eosinophilenzahl beobachtet (P < 0,05). Daher reagierten die Organe, in denen Eosinophile aktiver sind, besser auf BEO-Tiere. Es wurden keine Unterschiede in der intestinalen Genexpression im Immunkontext gefunden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Ergänzung ätherischer Öle bei MR zur Darmentwicklung und Immunfunktion beitragen könnte. Es sind jedoch weitere Untersuchungen erforderlich, um die Auswirkungen auf die Körperentwicklung zu verstehen und die beste Dosierung und Verabreichungsart festzulegen.

Der Einsatz antimikrobieller Mittel als Wachstumsförderer bei Nutztieren wurde in letzter Zeit in Frage gestellt, insbesondere wegen der Möglichkeit der Entstehung bakterieller Resistenzen und eines Gesundheitskonzepts1,2,3. Antimikrobielle Mittel zur Behandlung von Nutztieren, insbesondere von Neugeborenenkrankheiten, geben Anlass zur Sorge, da es sich bei ihnen um die gleichen Arzneimittel wie in der Humanmedizin handelt2,4. Darüber hinaus könnte der falsche Einsatz antimikrobieller Mittel zur Vorbeugung oder Behandlung von Krankheiten die Widerstandsfähigkeit der Krankheitserreger erhöhen und das Immunsystem des Wirts durch Darmdysbiose schwächen 6,7. Es muss auch darauf hingewiesen werden, dass das Wohlergehen der Tiere mit der Tiergesundheit und dem Einsatz antimikrobieller Mittel in Milchviehbetrieben zusammenhängt, ein Punkt, der zur Beurteilung des Zustands und des Wohlbefindens der Tiere gemessen wird5. Daher werden die Richtlinien zum Einsatz antimikrobieller Mittel zur Behandlung von Krankheiten in Milchviehbetrieben und zur Rationalisierung ihres Einsatzes von mehreren nationalen Veterinärorganisationen ständig aktualisiert1.

Die Zeit vor dem Absetzen ist in einem Milchviehbetrieb die Phase mit der höchsten Sterblichkeitsrate4,5. Die Kälber verfügen noch über ein unausgereiftes Immunsystem und sind anfällig für Darm- und Atemwegserkrankungen6. Der Magen-Darm-Trakt (GIT) ist das größte Organ des Immunsystems7. Da die Darmmikrobiota eine wichtige Rolle bei der Regulierung von Immunreaktionen außerhalb des Darms spielt, ist es daher wichtig, eine gute Mikrobenbesiedelung an dieser Stelle sicherzustellen und zu verbessern8. Das Darmmikrobiom wird für die Optimierung der Leistung und Gesundheit der Kälber von entscheidender Bedeutung sein9. Sobald jedoch das Pansen- und Darmmikrobiom bei einem älteren Tier etabliert und vollständig ist, ist es schwierig, dieses Ökosystem dauerhaft zu manipulieren13. Aus diesem Grund ist die Manipulation und Entwicklung der Darmmikrobiota des Kalbes in jungen Jahren wichtig, da sie eine Gelegenheit bietet, Stoffwechsel, Wachstum und Immunantwort zu steuern9,10.

Daher könnten einige Ernährungspraktiken und Zusatzstoffe die Nährstoffnutzung und die Homöostase der kommensalen Mikrobiota sowie die Immunantwort der Tiere beeinflussen, insbesondere im frühen Leben11,12,13. Die Ergänzung mit Kolostrum und Übergangsmilch in den ersten Lebenstagen, die Pansen-Transfaunationsimpfung sowie die Ergänzung mit Prä- und Probiotika sind potenzielle Strategien zur Manipulation und Verbesserung der mikrobiellen Besiedlung und Darmentwicklung des jungen Kalbes und damit zur Verbesserung seines Immunsystems9,14. Daher wurde nach Futterzusätzen als Alternative gesucht, die nicht nur die Leistung von Nutztieren verbessern, sondern auch entzündungshemmende, antimikrobielle, ruminalmodulierende, antioxidative und immunologische Verbesserungen bewirken15. Bei der Ergänzung von Futtermittelzusatzstoffen, die als Wachstumsförderer in Frage kommen könnten, sind ätherische Öle (EO) ein anhaltend heißes Thema.

Bei den EO handelt es sich um pflanzliche Metaboliten, natürliche Extrakte mit antibakterieller, antiviraler, antimykotischer, antioxidativer und entzündungshemmender Wirkung16,17, die sich positiv auf die Darmmikrobiota18 und die Kälberleistung19 auswirken. Zur Gewinnung von EO werden unterschiedliche Pflanzen sowie in jedem dieser Öle unterschiedliche Moleküle mit unterschiedlichen Wirkungen verwendet17,20. Daher wurden kürzlich Zusatzstoffe getestet, die eine Kombination dieser EO oder Mischungen verwenden, um das Ökosystem und die Mikrobiota des Pansens zu verändern und die Nährstoffverwertung, Leistung und Gesundheit in den frühen Lebensphasen zu verbessern9. Frühere Ergebnisse mit der Verwendung von EO verschiedener Pflanzen in einer flüssigen Nahrung haben potenzielle Vorteile für das Wachstum und die Verbesserung der Gesundheit von Kälbern gezeigt21, es liegen jedoch nur begrenzte Informationen über seine Verwendung bei jungen Wiederkäuern vor.

Ziel dieser Studie war es, die Wirkung einer kommerziellen Mischung aus EO-Supplementierung in Milchaustauscher (MR) auf Immunität, Nährstoffverdaulichkeit, Organentwicklung und Genexpression bei Milchbullenkälbern während der Phase vor dem Absetzen zu bewerten. Leistungs- und Übertragungseffekte wurden in unserer vorherigen Arbeit22 bewertet und in der vorliegenden Arbeit mit beschreibendem Zweck demonstriert. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine EO-Supplementierung durch flüssige Nahrung die Immunantwort verstärken, die Darmentwicklung unterstützen und folglich die Nährstoffverdaulichkeit erhöhen könnte.

Für dieses Experiment wurden die Richtlinien des Tierpflege- und Verwendungsprotokolls unter der Protokollnummer 9078250118 strikt befolgt, die von der Ethikkommission für Milchvieh von Embrapa (Brasilianische Agrarforschungsgesellschaft) genehmigt wurden. Das Embrapa wurde vom brasilianischen Ministerium für Landwirtschaft, Viehzucht und Lebensmittelversorgung gegründet.

Diese Studie wurde von März bis Juli 2018 in Embrapa-Milchviehbetrieben (Coronel Pacheco, Brasilien) durchgeführt. Sechzehn neugeborene Holstein- und Kreuzungskälber (Holstein × Gyr) mit einem durchschnittlichen Anfangskörpergewicht von 33,3 ± 3,7 kg wurden sofort von ihren Müttern getrennt nach der Geburt und für diesen Versuch verwendet. Sie erhielten in den ersten sechs Lebensstunden 10 % ihres Körpergewichts hochwertiges Kolostrum (Brix > 23 %) und ließen ihre Nabelschnur in den ersten drei Lebenstagen in eine 10 %ige Jodlösung eintauchen. Die Bullenkälber wurden in einem Stall mit offenen Seiten in einzelnen Sandbuchten (1,25 × 1,75 m) untergebracht und mit 1,2 m langen Ketten angebunden. Wasser nach Belieben und handelsüblicher Kälberstarter (Soymax Rumen pre-initial Flocculated, Total Alimentos, Três Corações, Brasilien, Tabelle 1) wurden während des gesamten Versuchszeitraums seit dem ersten Lebenstag bereitgestellt.

Zweimal täglich (08:00 und 16:00 Uhr) wurde eine flüssige Nahrung in Eimern mit Gummisaugern (Milkbar, Neuseeland) bereitgestellt. Am 2. und 3. Lebenstag erhielten die Kälber 5 l/Tag Übergangsmilch, gleichmäßig auf zwei Mahlzeiten verteilt, und vom 4. bis 60. Lebenstag wurden sie mit 5 l/Tag Milchaustauscher gefüttert, gleichmäßig auf zwei Mahlzeiten verteilt (MR, Kalvolak). , Nutrifeed, Niederlande; Tabelle 1), rekonstituiert, um 15 % der Gesamtfeststoffe, 194 g Rohprotein und 60 g Fett zu liefern. Der passive Immuntransfer wurde am 3. Tag überprüft, wo eine Serumprobe mittels Jugularvenenpunktion entnommen wurde. Die Röhrchen wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur belassen und dann 10 Minuten lang bei 1800 × g (22–25 °C) zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde das Serum in einem Brix-Refraktometer (Aichose-Refraktometer, Xindacheng, Shandong, China) bewertet. Kälber wurden nur aufgenommen, wenn der Brix-Wert höher als 8,4 % war.

An Tag 4 wurden Bullenkälber nach dem Zufallsprinzip einer von zwei Behandlungen zugeteilt: (i) Kontrolle (CON, kein Zusatz; n = 8) und (ii) Ergänzung mit einer Mischung aus ätherischen Ölen (BEO, 1 g/Tag/Kalb, Apex-Kalb, Adisseo, China; n = 8). Während des Einsatzes wurden Geburtsmonat, Gewicht und Brix überprüft, um sicherzustellen, dass beide Behandlungen ausgewogen waren. Apex-Kalb (Apex Calf, Adisseo, China) ist ein kommerzieller Zusatzstoff, der eine Mischung aus Pflanzenextrakten aus Anis, Zimt, Knoblauch, Rosmarin und Thymian enthält. Dieses Additiv wurde während des Experiments gemäß den Empfehlungen des Herstellers in den MR eingearbeitet. Die Menge des Zusatzstoffs für jede Mahlzeit wurde zuvor abgewogen und in 15-ml-Röhrchen in einer dunklen Box aufbewahrt. Diese Menge wurde mit 10 ml MR gemischt, homogenisiert und in 0,49 l MR (0,5 g/Kalb bei der Morgenmahlzeit und 0,5 g/Kalb bei der Nachmittagsmahlzeit) eingearbeitet, um eine vollständige Aufnahme des Produkts sicherzustellen. Sobald das Tier mit der Aufnahme von 0,5 l MR mit 0,5 g des Zusatzstoffs fertig war, wurde der Eimer mit dem Rest des MR wieder aufgefüllt.

Zu beschreibenden Zwecken wurden die Futteraufnahme (MR, Starter und Wasser), die Leistung und die Entwicklung des Körperbaus im Alter zwischen 4 und 60 Tagen gemessen. Die Futteraufnahme wurde täglich berechnet, indem die Verweigerungen von der bereitgestellten Menge abgezogen wurden. Dreimal pro Woche wurden MR- und Starterproben entnommen, um einen wöchentlichen Pool für die Nährstoffanalyse zu erhalten.

Das Körpergewicht (BW) und die Körperbauentwicklung (Widerristhöhe (WH), Rumpfhöhe (RH) und Herzumfang (HG)) wurden wöchentlich vor der Morgenmahlzeit mit einer Waage (ICS 300, Coimma, Dracena, Brasilien), ein tragbares Hypometer und ein Maßband.

Die Futterverdaulichkeit wurde während der letzten fünf Tage des Versuchs im Alter zwischen 56 und 60 Jahren gemessen. Auf jeden einzelnen Stall wurde eine Gummimatte (WingFlex, Kraiburg TPE GmbH & Co., Waldkraiburg, Deutschland) gelegt, um die tägliche Kotsammlung zu ermöglichen. Der Kot wurde täglich vom 56. bis zum 60. Tag gesammelt und gewogen und zur weiteren Analyse bei –20 ° C eingefroren. Am Tag 59 wurden 59 Tiere in Stoffwechselkäfige (1,5 × 0,8 m, Intergado Ltda., Contagem, Brasilien) überführt, wo sie 24 Stunden lang Urin sammelten und am letzten Tag der Stuhlprobe entnommen wurden. Der Kolben, in dem der Urin während des Versuchs aufbewahrt wurde, wurde in einen mit Eis bedeckten Kühler gestellt, um Bakterienwachstum und Stickstoffverlust zu vermeiden. Nach der Sammelperiode wurden das Gesamtvolumen, das Gewicht und die Dichte des Urins aufgezeichnet und eine Probe zur weiteren Analyse bei –20 °C eingefroren. Während des Verdaulichkeitsversuchs wurden MR-, Starter- und Verweigerungsproben gesammelt und für die fünf Tage gepoolt und zur weiteren Analyse bei –20 °C gelagert und eingefroren.

Starter- und MR-Proben wurden wöchentlich und während des Verdaulichkeitsversuchs entnommen. Der während der Verdauung gesammelte Kot wurde 72 Stunden lang bei 55 °C ofengetrocknet und zur Analyse in einer Wiley-Mühle (Modell 3, Arthur H. Thomas Co., Philadelphia, PA) durch ein 1-mm-Sieb gemahlen. Sie wurden analysiert, um Trockenmasse (DM, Methode 934.01), Rohprotein (CP, Methode 988.05), Etherextrakt (EE, Methode 920.39) und Asche (Methode 942.05) gemäß AOAC23 zu bestimmen. Die Konzentrationen an neutralen Waschmittelfasern (NDF) und sauren Waschmittelfasern (ADF) wurden nacheinander mit der von Van Soest et al.24 beschriebenen Methode bestimmt. Die Bruttoenergie wurde mit einem adiabatischen Bombenkalorimeter (Parr Instrument Company, Moline, IL) bestimmt.

Die scheinbare Verdaulichkeit jedes Nährstoffs (%) wurde unter Berücksichtigung der Nährstoffaufnahme (NI) und der Nährstoffrückgewinnung im Kot (NFR) anhand der Formel bestimmt:

Die Stickstoffbilanz wurde anhand der Differenz zwischen der Stickstoffaufnahme (NI) und dem Stickstoff im Stuhl (NF) und im Harnstickstoff (NU) anhand der Formel bestimmt:

Die Bruttoenergieaufnahme (GEI) wurde anhand der Differenz zwischen der Bruttoenergie der bereitgestellten Nahrung (Starter-Bruttoenergie (GES) und MR-Bruttoenergie (GEMR)) und der Verweigerungs-Bruttoenergie (GER) anhand der Formel bestimmt:

Die verdauliche Energieaufnahme (DEI) wurde durch die Differenz zwischen GEI und Energieausscheidung im Stuhl (GEF) bestimmt. Um die Aufnahme metabolisierbarer Energie (MEI) zu bestimmen, wurden die Energieverluste aus dem Urin (GEU) vom DEI abgezogen.

Um einen Ausgangswert zu erhalten, wurden bei der Geburt vor der Aufnahme von Kolostrum Halsschlagaderblutproben entnommen. Danach erfolgte eine wöchentliche Sammlung 3 Stunden nach der morgendlichen Fütterung, um die Serumkonzentrationen von Beta-Hydroxybuttersäure (BHB), Serumharnstoff mit Röhrchen ohne Antikoagulans, Plasmaglukose mit Natriumfluoridröhrchen und alle zwei Wochen für plasmatisches IGF-1 mit zu ermitteln Heparinröhrchen (Labor Import, Osasco, Brasilien). Die Röhrchen wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur (22–25 °C) mit 3000 × g zentrifugiert, und Duplikate jeder Probe wurden einzeln in Mikroröhrchen verteilt und zur weiteren Analyse bei –20 °C eingefroren. Die Serumkonzentration von BHB und Harnstoff wurde mit einem Autoanalysator (Cobas Mira Plus, Roche Diagnostic Systems, Risch-Rotkreuz, Schweiz) unter Verwendung kommerzieller Kits (Ranbut-D-3-Hidroxibutyrate, Randox Laboratories Ltd., Antrim, UK; Harnstoff UV, Kovalent do Brasil Ltda., Bom Retiro São Gonçalo, Brasilien). Die Plasmaglukose wurde in einem Mikroplatten-Spektrophotometer EON (Biotek Instruments Inc., Winooski, VT) unter Verwendung der enzymatischen kolorimetrischen Methode (Kovalent do Brasil Ltda., Rio de Janeiro, Brasilien) gemessen. Die Plasma-IGF-1-Konzentrationen wurden mithilfe eines Chemilumineszenz-Assays analysiert (Immulite2000 Systems 1038144, IGF-1 200, Siemens Healthcare Diagnostics Products Ltd., Llanberis, Gwynedd, UK).

An den Tagen 0, 30 und 60 wurden Blutproben für ein vollständiges Blutbild durch Punktion der Halsvene in EDTA-Röhrchen (Labor Import, Osasco, Brasilien) entnommen und sofort auf Eis ins Labor transportiert. Ein automatischer hämatologischer Zellzähler (SDH – 3 vet, Labtest Diagnóstica SA, Brasilien) wurde zur Auswertung verwendet: Anzahl roter Blutkörperchen (RBC), Volumen gepackter Zellen (PCV), Hämoglobin (Hb), mittleres Korpuskularvolumen (MCV), Mittelwert korpuskuläre Hämoglobinkonzentration (MCHC), Thrombozytenzahl und Gesamtzahl der weißen Blutkörperchen. Eine manuelle Differenzialzählung der weißen Blutkörperchen wurde auch durch mikroskopische Untersuchung durchgeführt, wobei 100 Leukozyten in einer 1000-fachen mikroskopischen Vergrößerung auf Gesamtleukozytenzahl, Basophile, Eosinophile, Neutrophile, Bandneutrophile, segmentierte Neutrophile, Lymphozyten und Monozyten untersucht wurden. Morphologische Veränderungen wie toxische Neutrophile, reaktive Lymphozyten und aktivierte Monozyten wurden berechnet. Mit den vorherigen Ergebnissen wurde das Verhältnis von Blutplättchen zu Lymphozyten (PLR) und das Verhältnis von Neutrophilen zu Lymphozyten (NLR) berechnet. PRL und NRL sind neuartige Entzündungsmarker und wurden ausgewählt, um zu überprüfen, ob sie als Biomarker zur Vorhersage von Entzündung und Mortalität25 und zum Gleichgewicht zwischen Entzündung und adaptiver Immunität zur Vorhersage des Krankheitsverlaufs eingesetzt werden können, wie dies bereits in der Humanmedizin erfolgt26.

Alle Bullenkälber wurden am Tag 60 ± 1 eingeschläfert, um die Entwicklung der inneren Organe anhand der vom brasilianischen Bundesrat für Veterinärmedizin27 empfohlenen Verfahren zu vergleichen. Unmittelbar nach der Betäubung und Schlachtung wurde die Halsschlagader durchtrennt, um das zirkulierende Blut aus dem Körper abzulassen. Anschließend wurde die Bauchhöhle geöffnet und jeder Bereich des Magen-Darm-Trakts isoliert und abgebunden. Innere Organe und Körperteile wurden in der folgenden Reihenfolge entnommen und gewichtet: Milz, Blase, gesamter Darmtrakt, Leber, Bauchspeicheldrüse, Netz, perirenales Fett, Niere, Vormägen (Pansen-Retikulum, Omasum), Labmagen, Dünn- und Dickdarm, Zunge , Herz, Lunge + Luftröhre. Anschließend wurden die Organe mit biologischem Inhalt entleert und erneut gewogen (Blase, Pansen-Retikulum, Magen, Labmagen, Dünn- und Dickdarm). Das Gewicht der Organe wurde im Verhältnis zum Gewicht des leeren Tieres bewertet; Daher wurde das Flüssigkeitsgewicht des Tieres vom Lebendgewicht des Tieres abgezogen. Die Länge des Dünn- und Dickdarms wurde mit einem Maßband gemessen. Sofort wurden Pansen- und Blinddarmflüssigkeitsproben entnommen, um pH, VFA und NH3-N zu messen. Nach diesen Vorgängen wurden einige Teile anschließend entleert und anschließend erneut gewogen.

Für die vergleichende Histologie wurden etwa 9 cm2 große Flächenproben entnommen: Pansen-Ventralsack, Pansen-Rückensack, Omasum laminae, Labmagen, Zwölffingerdarm (zehn Zentimeter unter dem Labmagen), Ileum (40 cm vor der Verbindung zwischen Ileum und Blinddarm) und Dickdarm (40 cm). nach der Ileum-Zekum-Verbindung). Gewebeproben wurden sofort zur Fixierung in Flaschen mit Formalin gegeben. Achtundvierzig Stunden nach der Fixierung wurde das Formalin durch 70 %igen Alkohol ersetzt und vor Licht geschützt. Die Proben wurden so verarbeitet, dass sie Paraffin enthielten, und dann mit einem manuellen Mikrotom (Olympus CUT 4055, Tokio, Japan) in 5 µm dicke Schnitte geschnitten. Zur morphometrischen Analyse wurden die Blätter mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Die Bilder wurden mit einem Lichtmikroskop (Olympus CX31, Tokio, Japan) aufgenommen, das an eine Kamera (Olympus OSIS SC30, Tokio, Japan) angeschlossen war, unter Verwendung der Cell-B-Software (Olympus, Tokio, Japan). Für morphometrische Interpretationen wurde AxioVision 4.8.2-06/2010 (Carl Zeiss Images Systmes®237, Jena, Deutschland) verwendet. Für Pansen- und Omasumproben wurden die Fläche, die Höhe und der Mitoseindex (MI) der Papille der Basalschicht des Epithels analysiert. Zur MI-Bestimmung wurden 2000 Basalschichtzellen unter einem Lichtmikroskop gezählt. Bei der Schätzung wurde das Verhältnis zwischen der Anzahl der Zellen in der mitotischen Teilung und der insgesamt gezählten Zellzahl berücksichtigt28. Die Höhe (μm) und Fläche (μm2) der Zotten im Zwölffingerdarm- und Ileumbereich; Die Tiefe (μm) der Magengruben und Krypten im Zwölffingerdarm, Ileum und Dickdarm wurde gemessen. Die Zellproliferation wurde durch die Zählung mitotischer Figuren im Epithel der Magen- und Darmdrüsen in 10 Feldern mit einer 400-fachen Steigerung bestimmt.

An den Tagen 14, 28, 42 und 60 wurden Pansenflüssigkeitsproben unter Verwendung einer Speiseröhrensonde vier Stunden nach der morgendlichen Fütterung entnommen. Am Tag der Euthanasie wurden Proben direkt aus dem Pansen und Blinddarm der Tiere entnommen. Der pH-Wert im Pansen wurde sofort mit einem pH-Meter (Phmetro T-1000, Tekna, Araucária, Brasilien) gemessen. Zehn Milliliter der filtrierten Pansenflüssigkeit wurden dann für VFA-Analysen mit 2 ml 20 %iger Metaphosphorsäure und für NH3-N-Analysen zehn Milliliter mit 0,2 N 50 %iger Schwefelsäure angesäuert. Diese Proben wurden zur weiteren Analyse bei –20 °C gelagert. Für die NH3-N-Konzentration wurde eine von Chaney und Marbach29 vorgeschlagene kolorimetrische Destillationsmethode verwendet, bei der die Absorption bei 630 nm (Termo Fisher Scientific, Madison, USA) nach Kjedahl-Destillation mit Magnesiumoxid und Calciumchlorid gemessen wurde. Die VFA-Konzentrationen im Pansen wurden gaschromatographisch gemessen. Sie wurden aufgetaut und 15 Minuten lang bei 13.000 U/min und 13 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde wie zuvor beschrieben22 gesammelt, filtriert und analysiert.

Die Milzfunktion kombiniert die angeborene und adaptive Immunantwort und entfernt ältere Erythrozyten, Mikroorganismen und Zelltrümmer aus dem Kreislauf. Sie ist das wichtigste Organ für die antibakterielle und antimykotische Immunreaktivität30. Um die Zellproliferation gegenüber bakteriellen Antigenen zu bewerten, wurden unmittelbar nach der Schlachtung der Tiere und der Isolierung der Organe Messungen an der Milz vorgenommen und diese zur kurzen Verarbeitung in Eis gelegt.

Fünf Gramm des Gewebes wurden im Labor gemahlen, gefolgt von einer Dichtegradientenzentrifugation auf einer Ficoll-Hypaque-Lösung bei 400 g für 30 Minuten (Sigma, USA) zur Isolierung mononukleärer Zellen. Die Splenozytenzellen (5 × 106 Zellen/Well) wurden in Mikrokulturplatten mit flachem Boden ausgesät und mit Lipopolysaccharid aus E. coli (10 ng/ml; Sigma, USA) oder Phorbol 12-Myristat-13-Acetat (PMA) stimuliert ; 25 ng/ml) oder E. coli B41-Abstammungsextrakt (20 ng/ml) aus Streptomycin-resistenten Derivaten boviner ETEC-Stämme, isoliert nach Smith und Halls31. Die isolierte Kolonie der E. coli B41-Linie wurde lysiert und in PBS-Puffer verdünnt, dem ein Cocktail aus Proteaseinhibitoren (Protease Inhibitors Set, Sigma, USA) zugesetzt wurde. Die Wahl fiel auf E. coli und LPS, da E. coli einer der wichtigsten Vermittler von Kälberdurchfall in den ersten Lebenswochen ist32. Daher könnte es eine gute Wahl sein, die indirekten Auswirkungen des EO auf die Zellproliferation zu visualisieren.

Die mononukleären Zellen aus der Milz wurden dann in RPMI 1640-Medium (Sigma, USA) mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (Gibco, USA), 2 mM L-Glutamin (Sigma, USA) und 100 µg/ml Streptomycin kultiviert und 100 U/ml Penicillin (Sigma, USA) bei 37 °C in 5 % angefeuchtetem CO2. Die Zellproliferation wurde mittels MTT-Assay (3-(4,5-Dimethylthiazoyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid; Sigma, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers (Sigma) analysiert, wobei nicht stimulierte Zellen als Negativkontrolle verwendet wurden. Kurz gesagt, die stimulierten Splenozyten wurden 48 Stunden lang bei 37 °C in einem mit 5 % angefeuchteten CO2-Inkubator inkubiert. Anschließend wurden jeder Vertiefung zehn µL MTT (5 mg/ml) zugesetzt und die Inkubation erfolgte 4 Stunden lang bei 37 °C. Die Überstände wurden vorsichtig abgesaugt und 150 µL DMSO in jede Vertiefung gegeben. Die Platten wurden weitere 10 Minuten lang geschüttelt und die Absorptionswerte wurden bei 570 nm mit einem ELISA-Lesegerät abgelesen. Die Absorptionswerte wurden zwischen stimulierten und nicht stimulierten Gruppen verglichen.

Genexpressionsanalysen von Buffy-Coat-Zellen, Darmbein- und Dickdarmbiopsien wurden mittels RT-qPCR durchgeführt. Kurz gesagt, peripheres Vollblut aus den Gruppen CON (n = 8) und BEO (n = 8) wurde an den Tagen 30 und 60 gesammelt und zur Buffy-Coat-Isolierung 10 Minuten lang bei 800 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die weißen Blutkörperchen und Blutplättchen (Buffy Coat) bildeten eine Schicht auf den roten Blutkörperchen, die vorsichtig mit einer Mikropipette entfernt wurden. Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurden die roten Blutkörperchen dann mit Ammonium-Chlorid-Kalium-Lysepuffer (ACK; Thermoscientific, Waltham, USA) lysiert und nur die weiße Zellschicht wurde mit RNA-Schutzreagenz (Qiagen, Hilden, Deutschland) eingefroren. bis zur RNA-Extraktion. Die Ileum- und Dickdarmbiopsien wurden aus der Autopsie des Tieres entnommen und bis zur Analyse auf RNAprotect-Reagenz (Qigen, Hilden, Deutschland) aufbewahrt. Die RNA-Extraktion aus Buffy-Coat- und Organproben wurde mit dem RNeasy Mini-Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) durchgeführt. Die erhaltene Gesamt-RNA wurde mit dem Nanodrop 1000-Spektrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, USA) quantifiziert und die cDNA-Synthese wurde mit dem SuperScript III First-Strand-Kit (Thermo Scientific, Waltham, USA) durchgeführt, alles gemäß den Anweisungen des Herstellers33.

Die RT-qPCR-Assays erfolgten im 7500 Fast Real-Time PCR System (Thermo Scientific, Waltham, USA) unter Verwendung des PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Scientific, Waltham, USA) zur Überprüfung der Expression von Interleukin 6 (IL-6). und Interleukin 10 (IL-10)-Gene. Es wurden β-Actin, GAPDH und Ubiquitin als Referenzgene verwendet, basierend auf der mit der Online-Software RefFinder berechneten Expressionsstabilität. Für jede Probe wurde der Durchschnitt der Ct-Werte aus Zielen und Referenzgenen mithilfe der ABI Real-Time PCR 7500-Software Version 2.3 (Thermo Scientific, Waltham, USA) berechnet.

Die statistische Analyse wurde mit R® durchgeführt (R Core Team, 2019). Um die Hypothese der Auswirkung des BEO auf jedes Leistungsergebnis zu testen, wurde ein randomisiertes vollständiges Blockversuchsdesign mit wiederholten Messungen implementiert. Die Tiere wurden aufgrund der genetischen Zusammensetzung als ¾ oder 5/8 Holstein × Gyr-Kreuzungen blockiert. Die analysierten Ergebnisse waren Nährstoffverdaulichkeit, Organgewicht, Histologie, Pansen-, Blinddarm- und Blutparameter sowie Genexpression. Für jede Behandlung wurden acht Versuchseinheiten zugewiesen.

Jedes Ergebnis wurde unabhängig mithilfe linearer gemischter Modelle analysiert (Paket: nlme). Jedes unabhängige Ergebnis wurde als Funktion der folgenden festen Effekte modelliert: Behandlung, Versuchswoche und die Wechselwirkung zwischen Behandlung und Woche. Geburtsgewicht und Serum-Brix-Wert wurden als Kovariate getestet, verbesserten jedoch die statistische Signifikanz nicht. Daher wurden sie aus dem Modell entfernt. Als blockierender Effekt wurde die genetische Zusammensetzung des Tieres einbezogen. Die Wirkung von Bullenkalben im Rahmen der Behandlung wurde in die Modelle einbezogen, um individuelle Variabilität zu berücksichtigen. Alle Ergebnisse wurden auf Homogenität der Varianz und Normalität getestet, um die erforderlichen Annahmen dieses Modells zu erfüllen, wobei Residuen versus Anpassungen bzw. QQ-Diagramme verwendet wurden. Um die Annahme zu erfüllen, wurde eine Variablentransformation mit Box-Cox auf die Milchaustauscheraufnahme angewendet. Für alle Tests wurde ein 95 %-Konfidenzintervall angewendet.

Die kontinuierlichen Ergebnisse wie Aufnahme, strukturelles Wachstum, Leistung, Pansen und Blutparameter wurden mit ANOVA analysiert. P-Werte wurden mit einem Fisher-Test erstellt und die geschätzten Randmittelwerte und SEM wurden mit dem emmeans-Paket berechnet. Die kategorialen Ergebnisse der Stuhl- und Atemwegswerte wurden mithilfe eines nicht parametrisch ausgerichteten Rangtransformationstests analysiert, der im R-Paket ARTool implementiert ist.

Die Ergebnisse, die während der Studie ein einziges Maß hatten, wie z. B. Nährstoffverdaulichkeit, Stickstoffbilanz, Gewicht und Größe von Energieverteilungsorganen/Eingeweiden, Organhistologie, Splenozytenproliferation und Genexpression, wurden mithilfe des linearen gemischten Modells (Paket nlme) analysiert Kalb war der zufällige Effekt und die Behandlung war der feste Effekt.

Die Futteraufnahme, Leistung und Körpermaße wurden zu beschreibenden Zwecken ausgewertet und zeigten keine Unterschiede zwischen den Behandlungen. Der durchschnittliche passive Immuntransfer-Brix-Wert betrug 10,4 ± 1,0. Das Anfangs- und Endgewicht betrug 33,3 ± 3,7 kg bzw. 66,1 ± 4,5 kg, mit einem durchschnittlichen Wachstum von 11,3 ± 3,0, 12,1 ± 3,2 und 17,8 ± 3,7 cm für WH, RH und HG. Die Tiere hatten eine durchschnittliche Starter- und Wasseraufnahme von 0,27 ± 318 kg/Tag bzw. 1,29 ± 980,5 kg/Tag. Die MR-Aufnahme betrug 0,75 g/Tag mit einem Rückgang in den Wochen 2 und 3 auf 0,71 ± 0,022 g/Tag aufgrund des Auftretens von Durchfall.

Der pH-Wert im Pansen wies bei der BEO-Behandlung niedrigere Werte auf als bei CON (P = 0,02, Tabelle 2). Es wurde auch ein Wocheneffekt beobachtet, mit einem Rückgang der pH-Werte um 14 % von Woche 3 bis Woche 9 für beide Gruppen. Es gab keine Behandlungsunterschiede für den Pansen-Ammoniakstickstoff und alle gemessenen VFA. Wie beim pH-Wert beobachtet, gab es jedoch auch einen schwachen Effekt für die VFA- und C2:C3-Verhältnisse (P < 0,01, Tabelle 2), wobei die Werte aller VFA zunahmen und die Werte von C2:C3 sanken, je älter die Tiere wurden. Das C2:C3-Verhältnis zeigte ebenfalls eine Wechselwirkung zwischen Behandlung und Woche, wobei bei BEO-Tieren in Woche 3 bzw. 5 um 28 % bzw. 16 % höhere Werte beobachtet wurden. In den Wochen 7 und 9 führten diese Werte zu den dargestellten Unterschieden.

Die Parameter des Blinddarms wurden erst am letzten Tag des Versuchs nach der Euthanasie ausgewertet. Es gab keine Unterschiede innerhalb der Behandlungsgruppen für alle bewerteten Parameter (P > 0,05, Tabelle 2), mit Ausnahme der Buttersäurewerte, die für die BEO-Gruppe um 76 % höhere Werte aufwiesen (P = 0,05, Tabelle 2).

Es gab keine Unterschiede zwischen den Behandlungen für alle Stoffwechselparameter (BHB, Harnstoff und Glukose) und Hormonparameter (IGF-1) (P > 0,05, Tabelle 3). Alle diese Parameter zeigten jedoch einen Wocheneffekt (P < 0,01, Tabelle 3) und erhöhten die Konzentrationswerte mit zunehmendem Alter der Tiere. Was das Hämogramm betrifft, gab es im Laufe der Wochen nur einen Unterschied in der Größe der roten Blutkörperchen, mit einem Rückgang des MCV von Woche 1 bis 9 (P = 0,04, Tabelle 3). Ein Behandlungseffekt wurde für die Eosinophilenzahl und die Anzahl der weißen Blutkörperchen beobachtet, mit 2,4-fach niedrigeren Werten für die BEO-Gruppe (P = 0,04, Tabelle 3). Was den wöchentlichen Effekt auf die Anzahl der weißen Blutkörperchen anbelangt, beeinflusste das Alter die Anzahl der Eosinophilen, die Anzahl der segmentierten Neutrophilen, die Anzahl der Lymphozyten, PLR und NLR, wobei Unterschiede von Woche 1 bis 9 beobachtet wurden. Es gab eine signifikante Wechselwirkung von Behandlung × Woche für segmentierte Neutrophile (P = 0,04), wobei BEO-Tiere in Woche 5 im Vergleich zu CON-Tieren 50 % mehr Zellen hatten, in den anderen Wochen jedoch keine Unterschiede.

Die scheinbare Gesamtverdaulichkeit des Trakts und die Stickstoffbilanz wurden am Ende des Versuchs vom 56. bis zum 60. Tag ermittelt. Die Verdaulichkeit von DM, OM, Bruttoenergie, CP und EE unterschied sich nicht zwischen den Behandlungen (P > 0,05, Tabelle 4). Ergebnisse im Zusammenhang mit der Stickstoffbilanz zeigten auch ähnliche Werte zwischen den Behandlungen (P > 0,05, Tabelle 4).

Um das Endgewicht nicht zu beeinträchtigen, wurde am Morgen vor der Fütterung eine Euthanasie durchgeführt. Es gab keine Unterschiede zwischen den Behandlungen für das leere Körpergewicht (P = 0,12, Tabelle 5). Die meisten untersuchten Organe waren zwischen den Behandlungen statistisch ähnlich, mit Ausnahme der Bauchspeicheldrüse, der Atemwege und des Dünndarms. Die Bauchspeicheldrüse des BEO-Tiers war im Vergleich zum CON-Tier 30 % schwerer (P = 0,05, Tabelle 5). Die Lunge und die Luftröhre waren bei CON-Tieren im Vergleich zu BEO 11 % schwerer (P = 0,03, Tabelle 5). Darüber hinaus war der Dünndarm bei BEO-Tieren um 16 % schwerer (P = 0,03, Tabelle 5), abgesehen von keinem Unterschied in der Darmlänge.

Es gab keine Unterschiede in der Entwicklung und Histologie des Magen-Darm-Trakts (P > 0,05, Tabelle 6), mit Ausnahme der Höhe der Ileumzotten. Tiere aus BEO wiesen im Vergleich zu CON eine um 25 % höhere Zottenzahl auf (P = 0,02, Tabelle 6).

Es wurde ein Splenozytenproliferationstest durchgeführt, um den Ergänzungseffekt gegenüber der zellulären Reaktion auf bakterielle Antigene zu bewerten. Die Milzzellen wurden in vitro mit E. coli-Antigenextrakt und Lipopolysaccharid stimuliert. Um eine mögliche Wachstumshemmung von EO zu verifizieren, wurde PMA als Zellproliferationsaktivator über Proteinkinase C (PKC) verwendet. Allerdings gab es bei allen getesteten Behandlungen keine Unterschiede in der Splenozytenproliferation (Tabelle 7).

Die Genexpression wurde an weißen Blutkörperchen (Buffy Coat) im Alter von 30 und 60 Tagen sowie an Ileum und Dickdarm im Alter von 60 Tagen untersucht. Diese Proben wurden auf der Grundlage der vorherigen statistischen Ergebnisse dieser Arbeit und unserer vorherigen Ergebnisse22 ausgewählt und die ausgewerteten Gene waren Interleukin 6 (IL-6) und 10 (IL-10), da sie mit Entzündungsreaktionen und der Immunregulierung nach der Behandlung mit in Zusammenhang stehen BEO34,35. Es gab keine Unterschiede zwischen den Behandlungen hinsichtlich der relativen Genexpression von IL-6 und IL-10 im Buffy Coat, Ileum oder Dickdarm (P > 0,05, Tabelle 8). Die relative Genexpression von IL-6 und IL-10 stieg mit der Zeit im Buffy Coat an, war jedoch nicht signifikant (P > 0,05, Tabelle 8).

Die Erforschung und Nutzung von Alternativen zum Ersatz künstlicher Zusatzstoffe hat stark zugenommen, insbesondere nachdem antimikrobielle Mittel als Wachstumsförderer ein Problem für die Tierproduktion und die öffentliche Gesundheit darstellen2,36,37. Die EO weisen antimikrobielle Breitbandeigenschaften auf und verbessern das Wachstum und den Gesundheitszustand verschiedener Arten38,39,40. Es wurde bereits gezeigt, dass die EO-Supplementierung anderer Arten einen positiven Einfluss auf die Verbesserung der Magen-Darm-Enzymaktivität und die Erhaltung der Darmumgebung hatte41. Es liegen jedoch noch wenige Daten zur Bewertung von EO bei jungen Milchkälbern und ihren Auswirkungen auf die Darmentwicklung und die Immunfunktion vor. Daher zielte die vorliegende Studie darauf ab, die EO-Forschung auf einen weiteren Schritt zu bringen und die Auswirkungen der EO-Supplementierung auf die Organentwicklung und die Immunfunktion zu quantifizieren. Unsere wichtigsten Ergebnisse waren die positiven Auswirkungen auf das Gewicht der Bauchspeicheldrüse und des Dünndarms, die Histologie des Ileums und den Anstieg der Buttersäure im Blinddarm.

Die Aufnahme und Leistung zeigten das gleiche Muster wie bei den Weibchen in unserer vorherigen Arbeit22. Das Hauptziel der Kälberaufzucht ist die Verdoppelung des Absetzungsgewichts, was in diesem Versuch erreicht wurde. Allerdings sind die Aufnahme- und Leistungsergebnisse für mit EO ergänzte Tiere umstritten, und es mangelt an Arbeiten, die natürliche Zusatzstoffe durch eine flüssige Ernährung ergänzen. In unserem Versuch arbeiteten wir gemäß Herstellerempfehlung mit einer Dosierung von 1,0 g/Tag, aufgeteilt auf zwei Mahlzeiten.

Bei der Bewertung der Auswirkung der EO-Supplementierung auf den Magen-Darm-Trakt wurden Unterschiede bei den Pansen- und Blinddarmparametern festgestellt, wobei BEO-Tiere in den Wochen 3 und 5 einen niedrigeren pH-Wert im Pansen, einen höheren Anteil an Buttersäure im Blinddarm und höhere C2:C3-Verhältnisse im Pansen aufwiesen. Das ist bekannt Die Konzentrationen von VFA in verschiedenen Teilen des Gastrointestinaltrakts stehen in Zusammenhang mit der direkten Funktion der lokalen Mikrobiota. Daher können Zusatzstoffe, die Veränderungen in der Pansen- und Darmmikrobiota bewirken, zu Veränderungen des VFA- und Milchsäureprofils und folglich des pH-Werts im Pansen führen17,42. Frühere Arbeiten zeigten, dass mit EO ergänzte Kälber mehr nützliche Mikroorganismen in der Darmmikrobiota aufwiesen18 und dass einige EO möglicherweise eine neuronale Aktivität aufweisen, die das Verhalten der Tiere verändert43. Vorab entwöhnte Jersey-Kälber, die mit Grüntee-Extrakt oder Oregano-Extrakt behandelt wurden, erwarten im Vergleich zur Kontrollgruppe den Beginn des Wiederkäuens in einer Woche44. Darüber hinaus haben Studien an anderen Arten gezeigt, dass eine EO-Supplementierung die Zahl der gastrointestinalen symbiotischen Bakterien, die als Butyratproduzenten bekannt sind, steigert45,46. Daher könnte ein höherer Gehalt dieses AGV die Darmentwicklung und die Modulation der Immunantwort fördern47. Bei Wiederkäuern findet die höchste VFA-Konzentration im Pansen statt, die zweithöchste Konzentration findet sich im Blinddarm, wo die weitere Verdauung der Ballaststoffe stattfindet48. Das von der lokalen Mikrobiota produzierte Blinddarmbutyrat dient als primärer energetischer Nährstoff für Kolonozyten und reguliert mehrere Funktionen von Darmzellen, einschließlich Genexpression, Zelldifferenzierung, Gewebeentwicklung, Immunmodulation, Reduzierung von oxidativem Stress und Durchfallkontrolle, also die Funktion des Magen-Darm-Trakts. Es ist möglich, dass der Unterdarm mit den Vormägen kommuniziert, was bedeutet, dass Nährstoffe im Unterdarm zu nachfolgenden Anpassungen in den Vormägen führen können49. Diese Theorie könnte erklären, warum die EO im MR in unserem Versuch einen Einfluss auf die Pansenergebnisse hatte. Technisch gesehen würde EO, da es über flüssige Nahrung verabreicht wurde, durch die Speiseröhrenfurche in das Magen-Darm-Trakt und den Labmagen gelangen. Daher wurde erwartet, dass sich die EO nur auf die Darmentwicklung auswirken würde.

Darüber hinaus erfasst der Magen-Darm-Trakt die Nährstoffversorgung in den ersten Lebenswochen und kommuniziert mit anderen Organen, die an der Verdauung beteiligt sind, wie etwa der Leber und der Bauchspeicheldrüse49. Diese Manipulation wird auch für die zukünftige Leistung des Tieres in der Herde wichtig sein. Der Darm, insbesondere das Ileum, verfügt über Lymphknötchen, auch Peyer-Plaques genannt, die eine wichtige Rolle als „Immunsensor“ spielen und dabei helfen, die Epithelreparatur und die Aktivierung von Entzündungssensoren zu fördern, die Homöostase zu regulieren und das Vorhandensein angeborener Immunzellen im Darm zu regulieren der Darm50. Dieser Zusammenhang erklärt auch die Integration der Darmgesundheit und ihrer Immunzellen sowie deren Migration zu anderen Körperstellen, wie sie über einen enteromammären Weg zur Brustdrüse erfolgt51. Aufgrund dieser wissenschaftlichen Erkenntnisse kann man daher mit Sicherheit sagen, dass der Darm eine wichtige Rolle für das Immunsystem, die Mikrobiota und das Krankheitsverhalten spielt. Es stimuliert die Immunfunktion und die Entwicklung einer Schleimhautschicht und erleichtert so die Nährstoffaufnahme und die Wechselwirkung mit der mikrobiellen Aktivität52. In unserer Begleitarbeit22 weisen die BEO-Tiere niedrigere Werte für den Stuhlwert auf, was die positiven Ergebnisse für den Gastrointestinaltrakt in dieser vorliegenden Arbeit bestätigt.

Zusätzlich zu den chemischen Unterschieden im Magen-Darm-Trakt hatten die BEO-Tiere in unserer Arbeit eine schwerere Bauchspeicheldrüse und einen schwereren Darm sowie eine höhere Höhe der Ileumzotten, was darauf hindeutet, dass mit Nahrungsergänzung versorgte Tiere eine bessere Magen-Darm-Funktion und Nährstoffverdaulichkeit haben könnten. Eine schwerere Bauchspeicheldrüse weist auf eine erhöhte Aktivität in diesem Organ mit einer höheren Produktion von Enzymen und einem aktiveren Stoffwechsel hin53. Es ist bekannt, dass die Ernährung einen Einfluss auf die Entwicklung und Funktion der Bauchspeicheldrüse54 sowie einen Einfluss auf die Mikrobiota des Gastrointestinaltrakts und damit auf die Funktion dieses Organs haben kann55. Eine erhöhte Sekretion von Pankreasenzymen impliziert eine Anpassung des Darms an die Verwendung der Enzyme und bestätigt die Unterschiede, die bei Blinddarmbutyrat gefunden wurden. Da außerdem bekannt ist, dass ein schwererer Darm auf den Wassergehalt oder die Zellproliferation zurückzuführen sein könnte, deuten die am Ileum gefundenen histologischen Unterschiede darauf hin, dass der schwerere Darm auf einen höheren Zellgehalt zurückzuführen ist, der die Gewebeabsorption beeinflusst. Somit hatten BEO-Tiere einen ernährungsbedingten Einfluss des EO, der sich positiv auf das Gewicht der Bauchspeicheldrüse, die Darmentwicklung und den Stoffwechsel auswirkte. Daher wurden Unterschiede in der Nährstoffverdaulichkeit erwartet, aber nicht gefunden.

Die in diesem Versuch ermittelten Verdaulichkeitsergebnisse lagen im zuvor gemeldeten Normalbereich56,57,58. Entgegen unseren Erwartungen hatten beide Gruppen eine ähnliche Verdaulichkeit. Es wurde zuvor beschrieben, dass unterschiedliche Einschlussraten von Oregano EO, die auf die In-vitro-Verdaulichkeit getestet wurden, zeigten, dass hohe Einschlüsse die Verdaulichkeit und die Pansenparameter beeinträchtigen könnten. Allerdings könnten mittlere Einschlüsse die Pansenparameter und die lokale Mikrobiota positiv verändern und die Nährstoffverdaulichkeit erhöhen59. Bei Tests an Milchkühen veränderte die Ergänzung mit Oreganoblättern weder die Pansenparameter noch die scheinbare Nährstoffverdaulichkeit, verringerte jedoch den DMI und erhöhte die Futtereffizienz60. Bei jungen Kälbern erhöhte die Einbeziehung einer Kombination aus EO und Präbiotika in einem pelletierten Kälberstarter die Gesamtverdaulichkeit für DM, CP, ADF, NDF, Stärke und Mineralien56. Wenn EO im Starter mit Monensin ergänzt wurde, zeigte EO außerdem einen größeren Einfluss auf die Gesamtnährstoffverdaulichkeit, mit einem synergistischen Effekt, wenn es mit Monensin ergänzt wurde57. Das Fehlen von Unterschieden könnte auf den Nahrungsergänzungsweg, die Dosierung, andere Zusatzstoffe und Wechselwirkungen zwischen ihnen zurückzuführen sein oder darauf, dass die Tiere nicht ernährungstechnisch belastet waren. Es ist auch wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Kälber bei der Verbesserung der Verdaulichkeit in diesem Versuch in der 8. Woche einen stärker entwickelten Pansen hatten und mehr Starterfutter fraßen. Somit war der Anteil der Nährstoffaufnahme ab dem Starter höher. Wie bereits gezeigt, haben die Starterform und die Kohlenhydratquelle einen Einfluss auf die Gesamtverdaulichkeit des Verdauungstrakts58. Das EO wurde in diesem Versuch durch eine Flüssignahrung ergänzt, also ein Futter mit höherer Verdaulichkeit und Passagerate. Darüber hinaus wurden in unserem Versuch keine positiven oder nachteiligen Auswirkungen auf die Verdaulichkeit festgestellt. Um die EO-Supplementierung auf die Entwicklung des Magen-Darm-Trakts und ihre Auswirkungen auf die Verdauung und Absorption von Nährstoffen besser zu verstehen, sollten Verdaulichkeitsversuche im Zusammenhang mit gesundheitlichen Ereignissen durchgeführt werden, und die Tiere sollten ernährungsbedingten Herausforderungen ausgesetzt sein.

Abgesehen davon, dass es keine Unterschiede in der Nährstoffverwendung gibt, könnte die EO-Ergänzung dazu beitragen, die normale Darmmikrobiota zu kontrollieren und aufrechtzuerhalten und somit die Entwicklung des Kalbes zu unterstützen. Frühere Studien am Menschen haben gezeigt, dass EO am Entzündungsweg beteiligte Faktoren wie Tumornekrosefaktoren (TNF) und IL-6 regulieren und bei der Behandlung entzündlicher Erkrankungen helfen kann61. IL-6 ist ein Mediator, der zur Körperabwehr beiträgt und als Reaktion auf Infektionen und Gewebeschäden produziert wird. Es stimuliert die akute Entzündungsphase und unterstützt die Hämatopoese und die Immunfunktion, indem es die Differenzierung und Proliferation vieler nichtimmuner Zellen fördert62, was als gute Reaktion angesehen wird und dabei hilft, die Homöostase der Magen-Darm-Schleimhaut zu erreichen63. Wenn andererseits das Darmmikrobiom aufgrund von Stress (Entwöhnung, Transport und Krankheit), Veränderungen in der Futteraufnahme, Dehydrierung oder der Verwendung oraler antimikrobieller Mittel gestört ist, kommt es zu einer Dysbiose, die zu einem Anstieg von Entzündungsproteinen wie IL führt -6 und TNF7,64. Wenn diese Dysbiose ausgedehnter ist, führt sie zu einer schweren Entzündung und einem Zustand namens „Leaky Gut“, bei dem die engen Verbindungen der Enterozyten nicht richtig funktionieren, was dazu führt, dass Darmbakterien in den Blutkreislauf gelangen und die Leber umschaltet von einem Stoffwechselorgan zu einem Immunorgan, was zu einer Verringerung des Wachstums und der Leistung des Tieres führt63,65. Daher wird die Entwicklung eines adaptiven Immunsystems von der Darmmikrobiota koordiniert und ist wichtig für die Krankheitsresistenz6,7. Außerdem induziert der Anstieg von Butyrat eine gute Reaktion und hemmt Entzündungsreaktionen, indem er die Umwandlung unreifer T-Zellen in Treg-Zellen anregt, Entzündungszellen blockiert und IL-10 produziert, das die sekretorische IgA-Produktion und andere antibakterielle Peptide anregt und so hilft GIT-Abwehrmechanismus63. Allerdings neigen Tiere unter chronischem oder starkem Stress zu Unterschieden in der Zahl der Immunzellen mit höheren Eosinophilen und niedrigeren Leukozyten- und IL-6-Werten.

Wir haben in dieser Studie Unterschiede bei der Leukozytenzahl festgestellt. Allerdings haben wir bereits beobachtet, dass mit Nahrungsergänzungsmitteln behandelte Tiere eine höhere Leukozytenzahl aufwiesen22. Dies stimmt mit anderen Befunden überein, bei denen Stress ausgesetzte Tiere eine geringere Leukozytenzahl aufwiesen66, was die immunologische Wirkung der EO-Supplementierung belegt. Bei den Eosinophilen handelt es sich um Granulozytenzellen mit denselben phagozytischen und metabolischen Funktionen wie Neutrophile, die jedoch eine wichtige Rolle bei der Abtötung von Parasiten und der Behandlung bestimmter Arten von Allergien spielen67. Die niedrigeren Eosinophilenwerte bei den BEO-Tieren, die über die Wochen hinweg anhielten, könnten ebenfalls weitere Hinweise auf eine positive immunologische Wirkung der EO-Supplementierung liefern. Es ist auch wichtig zu erwähnen, dass Eosinophile für die lokale Abwehr verantwortlich sind, im Magen-Darm-Trakt und im Atmungsgewebe vorhanden sind und eine wichtige Rolle bei biologischen Funktionen und der Aufrechterhaltung der Homöostase spielen68. Wenn wir unsere Ergebnisse beobachten, sehen wir, dass die EO-Supplementierung nicht nur einen positiven Einfluss auf die Entwicklung des Magen-Darm-Trakts, sondern auch auf die Atemwege hatte. Frühere Arbeiten haben einen positiven Einfluss auf die sekundären Pflanzenbestandteile gegenüber Eosinophilen-vermittelten Entzündungen gezeigt69. Die hämatologischen Parameter und Neutrophilen lagen je nach Art und Alter im Normbereich70,71.

Atemwegserkrankungen und pulmonale Konsolidierungsbereiche wurden in diesem Versuch nicht erfasst. Allerdings stellte die CON-Gruppe schwerere Lungen vor, die ein Überbleibsel einer früheren Atemwegserkrankung und ein Ersatz des Epithels durch Bindegewebe sein könnten, also ein schwereres und dichteres Gewebe. Dieser Unterschied könnte mit der Rolle des Eosinophilen im Atemtrakt zusammenhängen, der die Fibrinansammlung, die Heilung und den Umbau des Organs reguliert68. Somit könnten die BEO-Tiere eine bessere Gewebeheilung, weniger oxidativen Stress und weniger lokale Entzündungen aufweisen35; daher leichtere Atemwege. Bei Tieren, die unter chronischem oder starkem Stress stehen, kommt es tendenziell zu Unterschieden in der Anzahl der Immunzellen mit höheren Eosinophilen, niedrigeren Leukozyten- und IL-666-Werten. Da BEO-Tiere in unserer vorherigen Arbeit innerhalb der ausgewerteten Wochen geringere Unterschiede im Atemwertscore und eine höhere Leukozytenzahl aufwiesen22, belegten die Atemwegs- und Blutergebnisse der vorliegenden Arbeit die immunologische Wirkung der BEO-Supplementierung.

Aufgrund der Eosinophilen- und Organunterschiede zwischen den Gruppen wurde außerdem erwartet, dass es Unterschiede bei Zytokinen und Entzündungsreaktionen gibt. Es ist bekannt, dass entzündungsfördernde Zytokine (TNF und IL-6) und entzündungshemmende Zytokine (IL-10) mit zunehmendem Alter tendenziell zunehmen7. Abgesehen von einem leichten Anstieg im Laufe der Zeit wurden in unserer Buffy-Coat-Analyse für IL-6 und IL-10 zwischen dem 30. und 60. Lebensjahr keine Unterschiede festgestellt, und es wurden keine Unterschiede zwischen den Behandlungen festgestellt. Dies könnte daran liegen, dass die Proben nur im Abstand von vier Wochen entnommen wurden.

Was die IL-6- und IL-10-Genexpression im Ileum und Dickdarm anbelangt, so erwarteten wir Unterschiede, obwohl sie zwischen den Behandlungen ähnlich waren, da es histologische Unterschiede im Ileum und einen höheren Butyratgehalt im Blinddarm bei BEO-Tieren gab. Wir hatten die statistische Aussagekraft, diese Variablen zu testen, und es gibt Hinweise darauf, dass die Darmmikrobiota mit RNA-Veränderungen und -Expression interagiert und diese beeinflusst72. Allerdings haben wir, wie auch für die Buffy-Coat-Ergebnisse erwähnt, die Proben möglicherweise zum falschen Zeitpunkt entnommen, um Unterschiede in der Genexpression festzustellen. Dies kann auch erklären, warum es keine Unterschiede in der Proliferation und Reizung der Splenozyten gab. Die Milz ist auch ein großes Immunorgan mit verschiedenen Immunzellen wie Lymphozyten und Makrophagen30. Daher wurde erwartet, dass die mit Nahrungsergänzung versorgten Kälber stärker auf LPS, PMA und E. coli-Extrakt reagierten und eine angeborene Immunantwort auslösten. Da diese Reaktion jedoch mit der Kapazität der IL-6-Sekretion korrelieren könnte, da IL-6 während der akuten Phase sezerniert wird und andere Interleukine mit Lymphoproliferation assoziiert sind, wurden für diesen Parameter keine Unterschiede festgestellt66, und beide Ergebnisse korrelieren miteinander. Die Milzzellen in unserem Versuch stammten von 60 Tage alten Kälbern, die gesund waren und keinem akuten Stress ausgesetzt waren. Es müssen neue Experimente mit unterschiedlichen EO-Konzentrationen und unterschiedlichen Zeitpunkten der Probenentnahme durchgeführt werden, um die durch diese Ergänzung geförderten Immunmodulationseffekte zu überprüfen. Gesundheits- und pathologische Herausforderungen sollten ebenfalls getestet werden, um signifikante Unterschiede in den immunologischen Reaktionen festzustellen, wie die Nahrungsergänzung zur Überwindung neonataler Krankheiten beiträgt, das Verhalten von Blutzellen, die Genexpression zum Zeitpunkt der Erkrankung und insbesondere das Verhalten der Mikrobiota von mit EO ergänzten Kälbern.

Die Fütterung vorab entwöhnter Bullenkälber mit einem EO im MR könnte eine vielversprechende Alternative sein, um die Darmentwicklung des Kalbes, insbesondere den unteren Darm, zu verbessern und die Reaktion der immunologischen Zellen auf gesundheitliche Herausforderungen im frühen Leben zu verbessern. Diese experimentelle Datenbank verbessert die Ergebnisse der Fütterung von EO an junge Kälber über eine flüssige Diät. Zukünftige Arbeiten sollten durchgeführt werden, um die Auswirkungen der Fütterung verschiedener EO, die optimale Dosierung, die Art der Bereitstellung und die Auswirkungen auf die Darmmikrobiota junger Milchkälber besser zu verstehen und zu bewerten.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in den Zusatzinformationsdateien enthalten.

Mischung aus ätherischen Ölen

Beta-Hydroxybuttersäure

E. coli-Extraktkontrolle

Körpergewicht

Kontrollgruppe

Rohprotein

Verdauliche Energieaufnahme

Trockenmasse

E. coli-Extrakt

Ätherextrakt

Essentielle Öle

Energetische Fäkalienausscheidung

Bruttoenergieaufnahme

Bruttoenergie des Milchaustauschers

Verweigert grobe Energie

Bruttoenergie des Starters

Energieverluste durch Urin

Magen-Darmtrakt

Hämoglobin

Herzumfang

E. coli-Lipopolysaccharid-Extrakt

Mittlere korpuskuläre Hämoglobinkonzentration

Mittlerer Korpuskularwert

Aufnahme metabolisierbarer Energie

Mitotischer Index

Milchaustauscher

Metabolisierbares Gewicht

Nährstoffrückgewinnung im Kot

Nährstoffaufnahme

Verhältnis von Neutrophilen zu Lymphozyten

Ammoniakstickstoff

Harnstickstoff

Organisches Material

Gepacktes Zellvolumen

Thrombozyten-Lymphozyten-Verhältnis

Phorbol 12-Myristat 13-Acetat Positive Kontrolle der Proliferation

Rotes Blutbild

Rumpfhöhe

Tumornekrosefaktor

Flüchtige Fettsäuren

Weiße Größe

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Die Autoren danken dem Nationalen Rat für wissenschaftliche und technologische Entwicklung (CNPq, Brasília, Brasilien), der brasilianischen Agrarforschungsgesellschaft (EMBRAPA), dem Nationalen Institut für Wissenschaft und Technologie – Tierwissenschaften (INCT-CA) und der Adisseo Company für die Finanzierung dieses Projekts.

Dieses Papier wurde von der Brasilianischen Agrarforschungsgesellschaft (EMBRAPA), der Adisseo Company (Projektnummer: 20500.18/0005-2), dem Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, Brasilien) und dem Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia Ciência Animal ( INCT, Viçosa, Brasilien). Die spezifischen Rollen dieser Autoren werden in der Erklärung „Autorenbeiträge“ dargelegt. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts und leisteten lediglich finanzielle Unterstützung.

Abteilung für Tierwissenschaften, Fakultät für Veterinärmedizin, Bundesuniversität Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, 30161-970, Brasilien

Joana P. Campolina, Sandra Gesteira Coelho, Anna Luiza Belli und Luiz F. Martins Neves

Embrapa-Milchvieh, Brasilianische Agrarforschungsgesellschaft (EMBRAPA), Juiz de Fora, MG, 36038-330, Brasilien

Fernanda S. Machado, Luiz GR Pereira, Thierry R. Tomich, Wanessa A. Carvalho, Rachel MP Daibert, Daniele RL Reis und Mariana M. Fields

Abteilung für Veterinärmedizin, Bundesuniversität Lavras, Lavras, Minas Gerais, Brasilien

Suely F. Costa

Adisseo, Campinas, Sao Paulo, Brasilien

Alessandra L. Voorsluys und David V. Jacob

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JPC: Methodik, formale Analyse, Untersuchung, Datenkuration, Schreiben – Originalentwurf, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung. SGC: Konzeptualisierung, Methodik, Ressourcen, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung, Überwachung, Projektverwaltung, Finanzierungsakquise. ALB: Methodik, Untersuchung, Datenkuration, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung. LFMN: Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung. FSM: Konzeptualisierung, Methodik, Ressourcen, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung. LGRP: Konzeptualisierung, Methodik, Ressourcen, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung. TRT: Konzeptualisierung, Methodik, Ressourcen, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung. WAC: Methodik, Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung. RMPD: Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung. DRLR: Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung. SFC: Methodik, Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung. ALV: Schreiben – Überprüfen und Bearbeiten, Visualisieren. DVJ: Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung. MMC: Konzeptualisierung, Methodik, Ressourcen, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, Visualisierung, Überwachung, Projektverwaltung, Finanzierungsakquise.

Korrespondenz mit Mariana M. Campos.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Campolina, JP, Coelho, SG, Belli, AL et al. Mögliche Vorteile einer Mischung aus ätherischen Ölen für den Stoffwechsel, die Verdaulichkeit, die Organentwicklung und die Genexpression von Milchkälbern. Sci Rep 13, 3378 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30088-y

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Eingegangen: 25. August 2022

Angenommen: 15. Februar 2023

Veröffentlicht: 28. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30088-y

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